成功案例

HE

基尔顿生物科技(上海)有限公司 

  

JRDUN Biotechnology(Shanghai)Co.,Ltd

 

实 验 报 告

 

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订单编号       JRD20150514XXXX         

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HE染色实验报告

前言

HE染色法,即是苏木精-伊红染色法。石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中基本、使用广泛的技术方法。

易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia );而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性(neutrophilia)。组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多,它们有不同的等电点。在普通染色法中,染色液的酸碱度为pH6左右,细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色,这些物质称为嗜碱性。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色,这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度,pH值升高时,则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性;pH值降低时,原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。

脱氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。

由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后,细胞核及钙盐粘液等呈蓝色,可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝,如处理适宜,可使细胞核着清楚的深蓝色,胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆,使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。

染色结果:细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色,软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色,粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性液体呈粉红色。

图1 HE染色结果示意图

材料与方法

1.1 主要试剂

试剂名称

厂家

货号

石蜡

上海国药集团

    69018961

甲醛

上海国药集团

    10010018

二甲苯

上海国药集团

    10023418

无水乙醇

上海国药集团

    10092680

氨水

上海国药集团

    10002118

苏木素

BASO

    714094

伊红

BASO

    BA4099

中性树脂

上海长岛生物技术有限公司

    G8590

1.2 主要仪器及耗材

仪器名称

厂家

型号

正置显微镜

OLYMPUS公司

CX41

移液

吉尔森P型移液器公司

P2P10P20P100P200P1000

恒温烘箱

上海恒一科学仪器有限公司

DHG-9023A

石蜡切片机

徕克公司

SQ2125

摊片机

徕克公司

PPTHK-21B

IMS图象分析系统

基尔顿生物科技(上海)有限公司

数码相机

NIKON公司

D5100

2方法

2.1样本包埋与固定

2.1.1取材和固定

切取组织时应使用锋利的刀、剪,切取组织块时,从刀的根部开始向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2~0.3cm,大小为1.5cm×1.5cm x 0.3cm为宜。取好的组织块置于10%福尔马林中固定48小时

2.1.2洗涤与脱水

将固定后的组织用流水冲洗,去除残留的固定液和杂质。不同浓度的乙醇逐级脱水,50%70%85%95%直至纯酒精(无水乙醇),每级2小时。脱水在有盖的瓶中进行,以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中,如需长期保存,可加入等量的甘油。

2.1.3透明

将组织块置入纯乙醇和二甲苯的等体积混合液中2小时,再进入纯二甲苯两小时,再一次纯二甲苯两小时;材料经过透明,会显示出前一步脱水的效果如何,若脱水,组织则显现透明状态,如组织中有白色云雾状,说明脱水不净,须返工处理,但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时,应避免其挥发和吸收空气中的水分,并保持其无水状态。

2.1.4浸蜡

浸蜡须在恒温箱中进行。先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍12小时,再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右

2.1.5包埋

包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是;先准备好纸盒,将熔蜡倒入盒内,迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部,切面朝下,再轻轻提起纸盒,平放在冷水中,待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中,使其迅速冷却凝固,30min后取出。

2.1.6切片

切片前将蜡块在-20度冰箱中至少放置30min,以增加硬度。将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧,固定蜡块底座或蜡块,调整蜡块与刀至合适位置,刀刃与蜡块表面呈5度角。调整切片机上的切片厚度为4-7μm,然后切片。

2.2  HE染色

2.2.1烤片和脱蜡

将玻片置于65℃恒温烘箱中烤片30min;置于二甲苯I中浸泡15min,再置于二甲苯II 中浸泡15min 

2.2.2水化

将脱蜡后的切片经酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精分别浸泡5min,自来水冲洗10min

2.2.3苏木素染色

将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色5min,氨水中分色,数秒钟。流水冲洗15min,入70%和90%酒精中脱水各10min

2.2.4伊红染色

入酒精伊红染色液染色1-2min,染色后的切片经纯酒精脱水。

2.2.5透明和封片 

将玻片置于二甲苯中透明3min×2次,中性树胶封片,放入65℃烘箱中15min

2.3 图像采集和分析

通过显微镜拍照,采集分析样本相关部位。

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