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原位杂交

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原位杂交  的详细介绍


原位杂交

原位杂交(in situ hybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交。用原位杂交技术,可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性,可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。


原位杂交实验步骤:前期胚胎的制备。

原位杂交**天进行重新水化和固定、预杂交、杂交。

原位杂交第二天进行 1 将探针回收,放于-20C保存(通常探针可重复使用十次左右)2加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升,60℃,放置30分钟,重复一次。3置换2XSSCT1ml,60℃,放置15分钟。4置换0.2XSSCT1ml,60℃,放置30分钟,重复一次。5用MABT洗两次,每次五分钟,放在摇床轻轻摇动。6室温下加1ml 1:2:7溶液,时间为一小时。  7  按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶连地高辛抗体,4C 冰箱过夜。

原位杂交第三天进行1) 用1ml含10%热灭**清的MABT溶液置换抗体溶液,放置摇床上25分钟,然后用1mlMABT置换,25分钟,再用1mlMABT溶液置换,一小时以上,后用1mlMABT溶液置换,25分钟。2) 用1ml 1mM米睉的Staining buffer洗三次,每次放置五分钟。3)将胚胎转入十六孔板中,吸去staining buffer,加上300ul BM Purple AP Substrate(底物,用之前加5mM米唑),十六孔板外面包上锡箔纸以避光,避免摇动,室温下显色。4)每隔一小时观察胚胎是否开始显色5)将显色的胚胎中的底物吸出,用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定,拍照。6)4C冰箱保存。


原位杂交服务内容:①细胞特异性mRNA转录的定位,可用于基因图谱,基因表达和基因组进化的研究;

                   ②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位,如EB病毒mRNA、巨细胞病毒DNA的检测;

                   ③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测;

                   ④基因在染色体上的定位;

                   ⑤检测染色体的变化,如染色体数量异常和染色体易位等;

                   ⑥分裂间期细胞遗传学的研究,如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定,某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。



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