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细胞培养的环境及条件有哪些?

细胞冻存方法、步骤及注意事项!

一、保存方法(主要有两个):

(1)传统方法:冷存管置于410分钟→ -2030分钟→ -8016~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。-20不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3/分钟之速度由室温降至(-80以下)-120,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。


二、步骤:

(1)冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。

(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO加入新鲜培养基中,*后浓度为5~10%,混合均匀,置于室温下待用。

(3)依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

(4)离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。


三、注意事项:

(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80–90%致密度。细胞冻存前应保证细胞的活力好,无污染

(2)冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

(3)一定要保证DMSO的浓度是10%,冻细胞要舍得用进口的DMSO

(4)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽**后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。

(5)慢冻,快解冻。细胞在 -15 度左右胞内形成结晶对细胞损伤,缓慢降温有助于减少损伤,故放入 -20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便,保存时间过久会影响细胞活力。


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