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神经元细胞培养

一、液体配制:Orthoboric acid 硼砂缓冲液:0.05M四硼化钠45ml,0.2M Orthoboric acid 55ml,pH8.4;胰酶-EDTA消化液:胰酶-0.125g;EDTA-0.2g;D-Hanks平衡盐液定容至100ml。所用的培养板、培养瓶或玻片预先经100μg/L多聚赖氨酸 Orthoboric acid盐缓冲液于37℃包被4h,三蒸水洗三遍晾干备用。

二、操作步骤如下:

1、出生2 d SD大鼠麻醉后,碘酒、75%乙醇**腹部皮肤,依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜,无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。

2、在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层,除去脑膜,剪碎组织成约1mm3大小,加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min,中间摇晃一次。

3、随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM+10%FBS)的离心管内终止消化液作用5min。

4、用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM+10%FBS的离心管内,用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次,静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2~3次。

5、将所收集的上清经200目筛网过滤。

6、过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min,弃上清,管内加入新鲜培养液(DMEM+20%FBS)并吹打成单细胞悬液。

7、细胞计数,调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内,放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。


三、无菌操作的注意事项:

细胞原代培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯**1h,操作前用75%乙醇**,穿上实验服,戴上口罩和帽子,操作时不能大声说话,双手戴上一次性橡胶手套,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

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