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Western blot实验问题答疑

Western blot实验中常常出现各种问题?基尔顿生物为您解答以下几点主要困惑:


1、蛋白质电泳时配制的凝胶为什么凝固前是有毒的,凝固后就无毒性了呢?

因为发发生了聚合反应,丙烯酰胺是单体,甲叉双丙烯酰胺是交联剂,在水溶液中,单体和交联剂通过自由基印发的聚合反应形成凝胶。


2、内参怎么做?是在同一张膜上还是另外再跑一张膜来做?是不是与蛋白的分子量大小有关系呢?

可以用同一张膜,转膜后先用目的蛋白的抗体做杂交,将抗体洗掉,再用内参抗体重新杂交,结果显示信号一致,就可以认为上样量一致。




3、WB电泳出现笑脸和哭脸的情况?

出现笑脸是因为灌胶的时候冷却不均匀,中间部分没冷却好,导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。


4、做western,背景很深,目的蛋白恨模糊,actin很清楚,什么原因?

背景比较重,可能是二抗浓度高了或者二抗洗得不彻底;如果是单纯的目的条带弱,有可能蛋白表达量本身就低,或者一抗浓度不够。


5、丽春红染膜能看到清晰的条带,但是发光的片子上去没有条带?

丽春红染膜能看到条带,只能说明转膜是没有问题的,所以没有条带应该是砖模后的步骤有问题。可排查后边的步骤。


6、转膜的时候蛋白marker是不是可转可不转,不转对后边实验是否有很大的影响?

这种方法在样本多的情况下很容易弄混,这么做主要是后期孵抗体的时候可以将膜封闭到很小的空间里进行孵育,可以节省抗体。

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