*新动态

RT-PCR实验操作过程

RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。


试验前注意:

1. 做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。

2. RT按要求做,一般不会出太大问题。

3. PCR如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。


试验过程:

实验器具:

1、 移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、 吸头:1ml、200μl、20μl

3、 匀浆管:5ml

4、 吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个

5、 EP管:1.5ml、0.2ml、100μl

6、 试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇

7、 量筒:50ml、250ml、500ml

8、 容量瓶:250ml、500ml、1000ml

9、 试管架:5ml、1.5ml、20μl

10、 盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水

11、 铝制饭盒:4个

12、 塑料小饭盒:1个

13、 大瓷缸:2个

14、 锡泊纸:一卷

15、 卷纸:2卷

16、 三角烧瓶:带盖,稍大


实验器具的处理与准备:

1、 塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)。

2、 玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)。

3、 匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC


试验试剂:

1、 DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、 75%乙醇:用无水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)。

3、 异丙醇:放入棕色瓶中。

4、 氯仿:放入棕色瓶中。

5、 琼脂糖


几种缓冲液的配制:

1、 电泳缓冲液: Tris? ?54g??硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml。

2、 5×TBE (贮存液)再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液加入450ml水——→500ml工作缓冲液。

3、 上样缓冲液:0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液,4℃保存


琼脂糖凝胶的配制:

1、 1.0%: 1.0g琼脂糖加入100ml电泳缓冲液中,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后进行电泳。

2、 1.5%:同上,将琼脂糖的量改为1.5g。

Rt-PCR材料:

Taq酶(含MgCl2 Buffer)

dNTP

oligo(dT)15

promega M-MLV

promega (Buffer)

RNasin

DEPC

Trizol

Invitrogen Life technologies

Marker


引物合成

1、 内参照:

正义:5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′

反义:5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′

β-actin

正义:5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′

反义:5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′

2、 par-4:

正义:5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′

反义:5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′

3、 退火温度计算

2(A+T)+4(G+C)

正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)

4、 引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好

5、 引物稀释:

加DEPC水量为(μl)= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100 稀释为10p mol / μl 浓度的引物溶液

试验步骤:

1. RNA提取(略参见RNA实验技术版块)

2. cDNA的合成:

逆转录体系的组成:

50ul PCR体系:

10×PCRbuffer 5ul

MgCl2 3ul(2.0mM)

10mMdNTPs 1ul

sense primer 1ul(1umol/l)

antisense primer 1ul(1umol/l)

cDNA 1.5ul

DEPC处理水 36.7ul

Taq 酶 0.8ul

总体积 50ul


3. PCR反应条件:

94 ℃ 5min

94 ℃ 1min

退火温度 40sec

72 ℃ 50sec

72 ℃ 7min

4 ℃ 0sec

29 cycles

取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳


4. 电泳:约1.25小时

先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察。

注意事项:

1、 逆转录的关键步骤是立即冰水浴。

2、 Rt时,先打开PCR预热30分钟。

3、 RNA抽提前,打开离心机预冷。

4、 在所有RNA实验中,关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要较大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压**等。

5、 做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。

6、 RT按要求做,一般不会出太大问题。

7、 PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

8、 注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人:氯仿、溴化乙锭(EB)、酚、异硫氰酸胍、紫外线等

课题设计、基金申请、文章润色、实验外包 基尔顿生物欢迎您的咨询!

沪公网安备 31011302004463号