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PCR实验操作注意事项

一、PCR实验室试剂配制要求:

PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的负压工作台或超净工作台进行配制和分装,所有的吸头和加样器都需固定放于其中,吸头不能用来吸取扩增后的DNA和其它来源DNA:

1、PCR用水应为高压的双蒸水;

2、引物和d-NTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制;

3、引物和d-NTP应分装储存,分装时应标明分装时间,以备发生污染时及时查找原因和追溯污染源头;


二、PCR实验操作注意事项

如果操作不规范,样品间的交叉污染是很容易出现的,从而产生假阳性问题。因此,不仅要在进行扩增反应时要谨慎对待,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应谨慎操作,一般需做到以下几点:

1、戴一次性手套,若不小心溅上反应液,应立即更换手套;

2、避免反应液飞溅,若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;

3、使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免空气中气溶胶的污染;

4、操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后再分装,这样既可以减少操作次数,避免污染,又可以增加反应的度;

5、加入反应模板,加入后盖紧反应管;

6、操作时设立空白对照和阴阳性对照,既可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;

7、由于实际操作时加样器很容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,所以操作者好使用高压处理过的或可替换的加样器。假如没有这种特殊的加样器,至少在PCR操作过程中加样器应该专用,严禁交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个相邻区域使用;

8、重复实验,验证结果,慎下结论。

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