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CCK8检测

Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】。它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。


一. 实验材料及试剂

96 孔板、CO2培养箱、酒精灯、移液枪、酶标仪等;细胞、CCK8等。



二、实验内容

取生长状态良好的对数生长期细胞,每孔按 4×103个接种至 96 孔板中,每组设置8个复孔,置于细胞培养箱中培养,待细胞贴壁后转染相应质粒后。继续培养 48h 后,弃含药培养基,每孔加入新鲜配制的含 10uL的毒性检测液CCK8,置于培养箱中继续培养 4h 后,用酶标仪测波长为450 nm的OD值。实验重复 3 次, 取实验结果的平均值作为终实验结果。按公式计算生长抑制率=[(对照组 OD-实验组 OD)/对照组 OD]  ×,以分组为横坐标,生长抑制率为纵坐标,绘制细胞生长抑制率柱状图。


当使用标准96孔板时,贴壁细胞的小接种量至少为1000 个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2500 个/孔(100μl培养基)。酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。


三、注意事项

CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免**污染,以免影响结果。CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存1年。当在培养箱内培养时,培养板外一圈的孔容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。在培养基中加入CCK8,培养的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑**的吸收,可在加入**的培养基中加入CCK8,培养的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话,将会抑制。悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

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