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三种小鼠酒精性肝病短期模型的评价

酒精性肝病 (alcohol liver disease, ALD) 是由过量酒精摄取导致的肝脏损伤, 包括酒精性脂肪肝 (alcoholic fatty liver, AFL) 、酒精性肝炎 (alcohol hepatitis, AH) 和肝纤维化/硬化 (alcoholic hepatic fibrosis/cirrhosis, AHF/AC) 等 , 在临床中常合并存在。研究发现, 90% 以上酗酒者易患脂肪肝, 其中10%~35%将发展为酒精性肝炎, 约8%~20%的慢性嗜酒者会进一步发展为肝硬化, 严重情况下会演变为肝癌。随着酒精生产工艺的简化和普及, 人类对酒精的摄取量不断增加, 由饮酒引发的健康问题也日益严峻。至 2009 年, 由饮酒导致的死亡人数占全球死亡人数总量的 3.8%。2013年, 中国成为仅次于英国的第二饮酒大国。北京302 医院统计, 在2002~2013年间, 医院接收的酒精性肝病患者(7422) 占所有肝病患者总人数 (188902) 的 3.93%, 酒精性肝病患者的住院率也由1.68% (2002年) 增至4.59% (2013年)。其中, 严重酒精性肝炎的患病率以2.4倍/年的速度不断攀升, 其90 天及1年内死亡率分别高达29% 和56%。目前, 临床缺乏针对性的****及方法, 多采用戒酒、营养支持、**保肝**改善患者肝脏生化指标、糖皮质**改善重症酒精性肝炎患者的生存率、抗肝纤维化**阻止细胞外基质沉积或促进其降解等措施, 而这些被动**手段存在疗效较差及不佳反应等较多问题。因此, 探讨 ALD 的发病机制并寻找有效**手段一直是该领域的研究热点。

迄今为止, 研究者们多集中于探讨酒精性肝病的发病机制; 虽然许多假说被提出, 但其系统性认知尚未构建。如何高效模拟人类酒精性肝病的动物模型具有十分重要的研究价值与临床意义。目前普遍使用的短期动物模型包括急性酒精灌胃模型、Gao-binge 模型和酒精液体饲料联合四氯化碳注射诱导的肝纤维化模型等。上述模型分别代表酒精性肝病的不同发病阶段。综上, 本研究将结合临床诊断标准与芯片数据, 着重探讨各模型诱导指标与临床数据的切合度及相对优势。

CCL2 (C-C motif chemokine receptor-2), 又称单核细胞趋化蛋白 1 (monocyte chemotactic protein 1, MCP-1), 是趋化因子家族的成员。单核细胞、巨噬细胞和肝星状细胞经多种生化因子刺激后, 均可分泌 CCL2。研究表明, CCL2在酒精性肝病患者血浆中的mRNA和蛋白表达水平均显著增高, 并在酒精诱导的肝脏炎症、脂质沉积中发挥重要的病理作用。但是在酒精性肝病各阶段的动物模型中, CCL2 的变化趋势报道较少。CCL2 能否成为潜在的生物标记物仍然未有定论。综上, 本研究结合临床诊断标准与芯片数据, 对3种较为普遍的酒精性肝病短期模型进行探讨, 筛选出建模方便、较为高效的动物模型并探索 CCL2 在各阶段酒精性肝病作为潜在生物标记物的可能性。

酒精性肝病分为脂肪肝、脂肪型肝炎、肝纤维化和肝硬化;目前,针对上述**的动物模型较为繁杂,诱导指标单一,且与临床指标有较大差异。其中,有3种短期模型应用较为普遍,分别为酒精灌胃诱导的急性肝损伤、短期液体饲料诱导的脂肪型肝炎(Gao-binge模型)及酒精液体饲料联合四氯化碳注射诱导的肝纤维化模型。

急性酒精性肝损伤模型8~10 周 C57BL/6J 雄性小鼠, 随机分为对照组及造模组, 每组 5 只。造模组按照6 g·kg−1 剂量灌胃40%乙醇, 每12 h 一次, 共3次。对照组给予等热量等体积的糊精。于后一次给药6 h 后, 乙醚麻醉, 处死并收取样本。实验期间, 自由饮水饮食。

短期酒精性肝炎模型根据 Gao-binge 模型, 选取 8~10 周 C57BL/6J 雄性小鼠称重, 按体重进行配对分组, 每组6只。, 均给予 Lieber-DeCarli 对照液体饲料 (脂肪热量 35%) 适应 5 天。于第 6 天, 造模组更换为 Lieber-DeCarli 5% (v/v) 酒精液体饲料; 共10 天。第11 天 7~9 点, 造模组灌胃给予 5 g·kg−1 乙醇, 对照组给予等热量等体积糊精。9 h 后, 处死并收取样本。实验期间, 自由饮用液体饲料。

短期酒精性肝纤维化模型按体重将 8~ 10 周 C57BL/6J 雄性小鼠配对分组, 每组 4 只。对照组给予 Lieber-DeCarli 对照液体饲料。第 1~2 天, 造模组给予含有1%乙醇 (v/v) 的 Lieber-DeCarli 酒精液体饲料, 第 3~4 天, 酒精含量翻倍。适应期后, 再用 2% Lieber-DeCarli 酒精液体饲料喂养2周。期间, 造模组腹腔注射四氯化碳 (1 μL·g −1 , 以 1∶3 的比例溶于橄榄油), 对照组注射橄榄油, 每周2次。后一次给药后72 h, 处死并收取样本。实验期间, 自由饮用液体饲料。

在本研究中,充分讨论了上述3种短期模型的病理指标,并根据参考文献和临床数据对其进行有效评价。结果发现,所有模型的造模组肝重比均明显高于对照组(P< 0.05),病理切片证实造模组有空泡样病变和脂质沉积。然而,对血清生化指标和炎症因子的诱导程度有较大差异。在急性肝损伤模型中,肝脏IL-6和CCL2的mRNA水平大幅下调(P<0.05),与单次过量饮酒患者的全血基因表达结果相似,而血清生化指标无变化趋势。Gao-binge模型中,造模组血清ALT、AST和T**平显著上升(P< 0.05),肝脏TG含量、IL-6和CCL2的mRNA表达水平也明显上调(P< 0.05),与临床脂肪型肝炎患者的病理指标一致。在肝纤维化模型中,除造模组出现明显的汇管区纤维化和少量脂滴聚集外,血清生化指标和炎症水平均无显著性变化。

综上,本研究表明,3种动物模型代表了酒精性肝病的各个阶段。其中,Gao-binge模型的建模方法相对简单,得到的,且与临床指标变化趋势相似,能较好地模拟人类酒精性脂肪性肝炎, 诱导的病理指标。CCL2 不仅具有成为酒精性肝病生物标记物的可能, 其表达结果还对酒精肝病各阶段的动物模型选择及评价有的参考价值。今后, 本课题组的工作将集中于研究 CCL2 在酒精性肝病各阶段中发挥的作用, 进一步探索 CCL2 成为酒精性肝病生物标记物的可能性, 并拓展 CCL2 的临床应用范围, 为 CCL2 成为酒精性肝病潜在**靶点的假设提供更充分的研究依据。

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