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荧光实验外包方法中的重要环节

**荧光实验外包方法中的重要环节

1、冰冻切片制备

建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定

切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10 min,尤其要较长时间保存的白片,要及时固定和适当保存。

3、血清封闭

为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30 min。

4、一抗孵育条件

在**组化反应中重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2 h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45 min。具体条件还要摸索。

5、二抗孵育条件

二抗一般室温或37度30 min-1 h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度,切记要避光反应。但在**荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6、复染

目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。

7、封片

为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗

为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3 min*3次,而一抗孵育后的清洗均为5次*5 min。注意(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染。(2)温柔冲洗,防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式;(3)冲洗的时间要足够,才能洗去结合的物质。(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训,当时我买的抗体稀释液偏酸,结果背景一片黄(未见特异性染色),建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于**复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于**复合物的形成,而高离子强度则有利于分解)

9、拍照

有条件的话好立即拍照,若不能及时拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序;应在暗室中进行检查;防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜;检查时间每次以1~2 h为宜,超过90 min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5 min后,荧光也明显减弱或褪色;激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象;所以多不得超过2~3 h;荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时,须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后;标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发;使用的玻片等载体,都厚度均匀,无明显的自发荧光,如果使用油镜,还镜油为无荧光镜油;电源好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效果。

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