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科研实验中不可避免的四大实验

对于 80% 的研究生而言,常规的检测类试验大家可能并不陌生,如蛋白水平检测的 WB,ELISA;**沉淀(IP)及**共沉淀(CO-IP);基因表达检测的 qPCR,原位杂交;**学检测中的**荧光,**组化,HE 染色等,今天就这些实验为大家做一个详细的汇总,希望可以帮大家理清这些实验的些许差异。


一、WB印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975 年,Southern 建立了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜(NC 膜)上,并利用 DNA-RNA 杂交检测特定的 DNA 片段的方法,称为 Southern 印迹法。而后人们用类似的方法,对 RNA 和蛋白质进行印迹分析,对 RNA 的印迹分析称为 Northern 印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern 印迹法。实验过程中常见的问题千千万,如胶不平?凝胶漏液?条带比正常的窄?「微笑」或「倒微笑」条带?凝胶肿胀或卷曲?条带歪斜或漂移?单个或多个白点?转膜缓冲液过热?~~你可以遇到 n 多问题,但是只要明白实验原理,一切问题都可以寻根究底。

二、荧光定量 PCR 技术(Real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量 PCR 是在普通 PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。在荧光定量 PCR 技术发展的过程中,两个重要的发现起着关键的作用:一是 Taq DNA 多聚酶的 5′ 端核酸外切酶活性被发现,它能降解特异性荧光标记的探针,使得间接检测 PCR 产物成为可能;另一个是荧光双标记探针被使用在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。目前该技术已经被广泛应用于基础科学,食品、医学、**开发以及分子生物学等多个领域,如:DNA 或 RNA 的定量检测应用;基因表达研究的检测应用,医学及**开发中的检测应用等。在基因表达的研究中,比较常用的方法是 Northern 杂交、RT-PCR 等方法, 传统的 Northern 杂交方法定量的下限为 106~107 个分子。这种方法需要的 mRNA 的量较大。对于较少的材料在研究基因表达上受到很大的限制。而荧光定量 PCR 技术对 mRNA 水平 的检测比 Northern 杂交、RT-PCR 等定量方法要方便、快速、准确得多。荧光定量 PCR 技术可以对不同组织、不同处理之间(如**处理、物理处理和化学处理等)、不同发育阶段基因表达差异进行检测,检测各基因在组织细胞中的表达丰度,分析基因的表达调控 、mRNA 的表达模式等研究。

三、**组织化学(immunohistochemistry)也称**细胞化学(immunocytochemistry)是将**学技术与组织病理学技术结合在一起,能对组织细胞内的化学成份、组织结构成分、微生物结构等进行显示和定位,从而分析、研究生物体的细胞组织代谢、功能及形态变化规律的科学。目前该技术在肿瘤的诊断应用包括:1. 确定细胞类型:通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分,以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记,前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮,甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记,而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞(如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、**结内指突状和树突状网织细胞)光镜下不易辨认,但**组化标记(S-100 蛋白等)能清楚显示其形态。2. 辨认细胞产物:利用某些细胞产物为抗原制备的抗体,可作为相应产物的特殊标记,如***细胞产生的各种**,大多数可用**组化技术标记出来,据此可对***肿瘤作功能分类,检测分泌异位**的肿瘤等。3. 发现微小转移灶:某些癌的早期转移有时与**结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的,而采用**组化方法(如用上皮性标志)则十分有助于微小(癌)转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助**组化标志寻找原发瘤,如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞,提示前列腺癌转移。4. 探讨肿瘤起源或分化表型:一些来源不明的肿瘤长期争论不休,后通过**组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤,曾被认为是肌源性的,但该肿瘤肌源性标记阴性,而神经性标记阳性,证明为神经来源(可能来自神经鞘细胞)。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等,通过多种标记的联合应用,也可能确定来源。

四、原位杂交组织化学(in situ hybridization , ISH)是运用核酸分子间碱基互补的性质结合组织化学和**组织化学技术,在组织切片(或细胞片)上显示特异核酸(DNA 或 RNA)顺序的一种技术。原位杂交组织化学的基础:1. 合适的探针:探针的种类和特异性;适宜的长度;良好的标记。2. 优良的组织保存:被测组织内核酸和组织结构完好;可靠的实验试剂和正确的实验方法;相当的形态学知识:细胞生物学,组织胚胎学,病理解剖学

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