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流式细胞实验中荧光染料的选择

(1)确定荧光染料本身所适合的流式细胞实验仪,需要了解染料的激发波长和发射波长、仪器所配制的检测滤光片和激发光源。

(2)了解荧光素的相对荧光强度:相对荧光强度反映的是荧光素-单抗结合物的亮度,其判断标准是染色指数。影响相对荧光强度的因素包括:不同仪器的激光及滤片组合不同,荧光素的相对荧光强度不同;抗体上荧光素分子的多少会影响相对的荧光强度。

(3)流式细胞实验选择原则:考虑抗原的密度高密度表达的抗原可考虑选择所有的荧光素;低密度表达的抗原需要可提供较高S/N比值的荧光素,如PE/APC。;自发荧光每种细胞群都有不同水平的自发荧光,所有的荧光通道均可观察的自发荧光,但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞,选择发射波长长的荧光素(APC)可得到较好的S/N比值,对于自发荧光强度弱的细胞,发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善,可选用FITC。;非特异性结合;复合染料避免信号衰退。复合染料因为光、固定剂或温度升高会导致信号衰退,使复合染料在上上等染料处发光。减少样本暴露于光、高温或固定剂,可很大程度上避免这一问题。若样本需要固定,要选择稳定的固定剂,可有效阻止复合染料的信号衰退。尽量减少信号间的干扰,检测的颜色越多,面临的信号干扰越多,选择试剂时尽可能降低荧光发射波长间的重叠。

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