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ChIP中的注意事项

从做染色质**共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation)中总结出值得大家注意的细节总结如下:
1、cell counting:尽量做到准确,会影响input结果。
2、cross link:甲醛的终浓度是1%,这个基本所有的protocol上都会强调。
3、resuspend cells with SDS:要选用小的tip头,在液面下吹打,否则很容易产生气泡,后面的sonication就麻烦了。
4、sonication:ChIP中重要的一部分,合适的条件要自己摸索,可以一次尝试不同次数的sonication,然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。
5、染色质**共沉淀实验中加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀,因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质,若不混匀,后面你会发现beads的量不一样,自然也会影响实验的结果。
6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净,但后一个要尽量吸干净,必要时可用gel loading tips吸。
7、含beads的samples离心时,有的protocol上推荐是1000rpm,45秒,但可以根据情况调整,但要注意转速不能太快防止beads破碎。(当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题)
8、reverse crosslink可以是65°C4个小时,也可以overnight。
9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心,把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。
10、染色质**共沉淀中每次行real time PCR之前都要把sample离心取样的准确。
11、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确,所以考虑好自己PCR反应体系的配置。
12、一个ChIP一般需要3~4天的时间,其中有几个步骤是可以停下来的:
1)细胞收集:用含蛋白酶抑制剂的PBS洗涤离心,去上清的细胞收集液可置-80°冻存;
2)用SDS重悬细胞后可置-80°冻存;
3)sonication结束,离心后的上清置新的离心管后可-80°冻存;
4)reverse cross-link后的标本可-80°冻存。
13、agarose beads 的wash过程中以及后面的DNA提取过程中乙醇的wash,可以用细胞室的那种吸引器,接上200ul的tip头吸,这样会节省很多时间(每个实验室情况可能不一样)。
14、DNA提取后建议用水溶解DNA,因为TE buffer里的EDTA可能会影响PCR反应体系中的Mg2+。
15、溶解DNA的水量可以根据PCR反应体系的要求适当调整。



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