病毒构建及包装技术(二)
三 逆转录病毒载体
逆转录病毒 一类含有逆转录酶的单链正链RNA病毒。逆转录病毒侵入宿主细胞后以自身RNA为模板,靠逆转录酶形成DNA环化后整合到宿主细胞的染色体中,以原病毒形式在宿主细胞中复制。 逆转录病毒的共同特性:
1.球形,有包膜,80~120 nm
2.基因组:单股RNA二聚体,核心有逆转录酶
3.复制通过DNA中间体,能与宿主细胞DNA整合 iku
病毒包装:
(一)应用
利用病毒载体借到目的基因的表达又称病毒包装,目前主要应用于:
1.病毒包装技术经历了多年的研究,已趋于成熟,可用于产业化大量生产。
2.病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚,稳定易于改造、易于制备。
3.病毒的宿主范围广,且具有高效的靶向特异性。
4.在目的基因表达方面相对于脂质体介导的效果更明显、长时、稳定。
5.通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构,安全性高。
(二)病毒包装的过程(慢病毒RNAi为例)
1. 根据目的基因相关信息(序列,序列号等),构建含有外源基因或siRNA的重组载体;(即质粒构建,已构建好,质粒可以保存)
2. 对于测序正确的重组质粒,提取和纯化高质量的不含内**的重组质粒;
3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T 细胞,进行病毒包装和生产,收集病毒液;
4. 浓缩、纯化病毒液;
5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞);
6. 通过定量PCR测定病毒滴度(高滴定方法)和Western 分析实验结果;
7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞;检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用**进行稳定转染细胞株的筛选,通常状况下,筛选的细胞株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。
附:
重组质粒构建流程
1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中,退火形成双链,PCR扩增)
2.回收
回收试剂盒
3.连接
4. 转化
5.抽提质粒(碱裂解法提取质粒DNA)
6.重组质粒克隆的鉴定
1)通过PCR方法鉴定:以重组质粒为模板,PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR扩增后电泳鉴定。
2)酶切鉴定:双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了
7. 质粒DNA的含量及纯度鉴定
浓度测定仪及琼脂糖凝胶检测