病毒构建及包装技术（二）
三 逆转录病毒载体
逆转录病毒 一类含有逆转录酶的单链正链RNA病毒。逆转录病毒侵入宿主细胞后以自身RNA为模板，靠逆转录酶形成DNA环化后整合到宿主细胞的染色体中，以原病毒形式在宿主细胞中复制。 逆转录病毒的共同特性：
1．球形，有包膜，80~120 nm
2．基因组：单股RNA二聚体，核心有逆转录酶
3．复制通过DNA中间体，能与宿主细胞DNA整合 iku
病毒包装：
（一）应用
利用病毒载体借到目的基因的表达又称病毒包装，目前主要应用于：
1．病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产。
2．病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备。
3．病毒的宿主范围广，且具有高效的靶向特异性。
4．在目的基因表达方面相对于脂质体介导的效果更明显、长时、稳定。
5．通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高。
（二）病毒包装的过程（慢病毒RNAi为例）
1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以保存）
2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内**的重组质粒；
3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T 细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；
4. 浓缩、纯化病毒液；
5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；
6. 通过定量PCR测定病毒滴度（高滴定方法）和Western 分析实验结果；
7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用**进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。
附：
重组质粒构建流程
1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增)
2.回收
回收试剂盒
3．连接
4. 转化
5．抽提质粒（碱裂解法提取质粒DNA)
6．重组质粒克隆的鉴定
1）通过PCR方法鉴定：以重组质粒为模板，PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR扩增后电泳鉴定。
2）酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了
7. 质粒DNA的含量及纯度鉴定
浓度测定仪及琼脂糖凝胶检测
